第6章分子生物学研究方法(下)剖析.ppt

第6章 分子生物学研究方法下,转录组指一个细胞内基因组DNA转录得到的所有转录产物以及转录物在细胞特定发育时期或特定生理条件下的表达水平,All transcripts,All mRNAs,6.1 基因表达研究技术,6.1.1 转录组测序,EST（Expressed Sequence tags，表达序列标签 ）EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5端和3端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到600bp 不等，平均长度为360 120bp。EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平,基因表达系列分析Serial Analysis of Gene Expression, SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。 SAGE的原理 1，一个910碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个9碱基顺序能够分辨262,144个不同的转录物，而人类基因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。 2，如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析,方法 以911bp作为标签（tag）49262144组合 串联tag并通过两端接头PCR扩增 扩增产物进行测序 每个tag通过Genebank或EST数据库进行比对 确认tag代表的基因表达情况,Next Generation Sequencing,Sample fragmentation Library preparation Sequencing reaction Data analysis,Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing,Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize,ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation,高通量测序High-throughput sequencing技术简介,Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize基本原理,Clonal Single Molecule Arrays单分子克隆,1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square 40 million clusters per experiment,Prepare DNA fragments,Ligate adapters,Attach single molecules to surface,Amplify to clusters,Reversible Terminator Chemistry可逆终止反应,All 4 labelled nucleotides in 1 reaction,Sequencing-by-Synthesis SBS,First base incorporated,Cycle 1 Add sequencing reagents,Remove unincorporated bases,Detect signal,Cycle 2-n Add sequencing reagents and repeat,1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团 2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号 3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应,T T T T T T T G T,T G C T A C G A T,The identity of each base of a cluster is read off from sequential images 根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列,Base calling from the raw data,Illumina Solexa 测序 Workflow,Illumina Sequencing Technology,有参考基因组序列生物信息分析,基因结构优化 鉴定基因可变剪接 预测新转录本 SNP 分析 基因融合鉴定,5.4.1 RACE 法克隆基因全长Rapid Amplification of cDNA Ends,根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因的全长cDNA序列。 cDNA 5端的快速扩增法5RACE cDNA 3端的快速扩增法3RACE,TdT 法原理,末端脱氧核苷酸转移酶,5 RACE原理,Adaptor-Adding 原理,Self-Ligation 法,3RACE 是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligodT的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。 用RNaseH 降解模板mRNA。 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增,RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为平衡剪切、5选择性剪切、3选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在选择性剪切,果蝇Dscam基因可 以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体,6.1.2 RNA选择性剪接技术,选择性剪切的不同类型,RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切,Hybridization of Nucleic Acids,RNA,DNA1,DNA2,DNA,Southern hybridization,Northern hybridization,探针,分子杂交技术,一）DNA变性与复性,DNA变性 1、定义某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性,2、变性的方法 （1）热变性温度升高到90100时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂,3、变性后的理化性质变化 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加,复性退火 1、定义变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA,2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子,核酸的分子杂交,将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子,一、 分子杂交的基本方法,Southern 印迹法 Northern 印迹法 原位杂交 斑点印迹杂交 Western 印迹法 Eastern印迹法 液相杂交,固相杂交,核酸分子杂交固相杂交操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,二、Southern blottingDNA印迹与杂交,1975年，英国Edwen Southern创建 定义检测DNA杂交方法，即将DNA电泳分离、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 应用基因组DNA的定性和定量分析 基因诊断、分子克隆、法医学等,在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交,材料尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE,步骤,第一 将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移,第二 是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交,杂 交 模 式 图,Southern bloting的主要步骤,1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性碱变性 4.Southern转膜印迹 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交预杂交、杂交、洗膜 6.杂交结果的检测,Southern 凝胶转移杂交技术,1. 待测DNA样品的制备、酶切 DNA的提取原理裂解细胞，使DNA释放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质,步骤解析,2. 待测DNA 样品的电泳分离 琼脂糖凝胶电泳,3. 凝胶中DNA的变性碱变性,凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液,4. Southern转膜印迹 待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上，即印迹,4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能 非特异吸附少,4.2 常用的固相支持物 硝酸纤维素膜优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 尼龙膜优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点杂交信号本底高 化学活化膜优点DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点结合能 力较上述两种膜低,4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓,冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,2）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上,3）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上,各种转移方法的比较 i 毛细管虹吸法操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70，毛细管法80）耗时多。 ii 电转移法效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 iii 真空转移法效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪,转移的最佳条件 i 固定基质的选择 ii 转移前预处理DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。 iii大分子的转移 对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟）水洗0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟转移,5、Southern杂交 1、预杂交封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA,6. 杂交结果的检测,化学显色或放射自显影,标记的探针,Southern Blotting overview,探针,是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技能，我们把标记的分子叫探针Probe。 从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。如抗体-抗体、外源凝集素-碳水合合物、亲合素-生物素、受体-配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶分子反应,一）探针的种类,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,二）标记物 理想标记物应具备的特性,高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,探针标记物 放射性标记物 32P 高放射性 半衰期14.3 d 35S 放射性较弱 半衰期87.1 d 3H 放射性弱 半衰期12.35 a 非放射性标记物 半抗原生物素、地高率 配体生物素是亲和素的配体 荧光素异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光,Biotin,Avidin,三）标记方法 体内标记法将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中,体外标记法 化学标记法标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上,酶促标记法 切口平移法（nick translation,1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口 2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除 3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,随机引物法所具有的优点 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记； 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题； 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/g DNA以上； 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,四）探针的纯化 1、乙醇沉淀法无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质； 2、凝胶过滤柱层析法利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50； 3、微柱离心法其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,四、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.10.5g，浓度过高影响杂 交效率,2、温度 （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025； （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值； （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,3、离子强度 （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加； （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,4、甲酰胺 （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50甲酰胺溶液在3542 杂交； （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,5、核酸分子的复杂性 （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度； （2）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,6、非特异性杂交反应 （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,Northern印迹杂交 1、 Northern blot印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交。 2、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 3、鉴别RNA 4、探针可用DNA或RNA片段 5、待测样品为总RNA或mRNA,Isolate mRNA Different Lengths,Probe with labeled DNA,Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA,斑点印迹杂交dot blotting,将RNA或DNA变性后直接点样于纤维素膜或尼龙膜上 优点简单、快速、可同时检测多个样品 缺点特异性不高、不能鉴别核酸分子量 应用确定DNA样品之间的同源性,核酸原位杂交in situ hybridization,1. 定义将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。 2. 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,核酸原位杂交的基本步骤,1. 细胞或组织的固定载玻片 2. 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 3. 探针的选择和标记 4. 杂交 5. 杂交结果检测,1. 荧光染色体原位杂交Fluorescence in situ Hybridization；FISH 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。 2. 多色荧光染色体原位杂交multicolor FISH; mFISH 3. 比较基因组原位杂交Comparative Genomic Hybridization；CGH,由原位杂交发展起的一些新技术,多色FISH（M-FISH技术,荧光原位杂交,液相杂交,指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程,Western Blotting,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测,Western Blotting 方法一 直接法,优点 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 缺点 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便,Western Blotting 方法二 间接法,优点 1. 免疫特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 4. 可选择不同的Marker 缺点 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化,间接Western Blotting操作流程,Western Blot 优点,高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白,Western Blot应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,Western Blot 流程,蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的提取,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量Bradford法考马斯亮蓝法、Lowry法Folin-酚试剂法、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度,蛋白样品的变性,2SDS-PAGE上样缓冲液 DTT可临用前以14比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 按11比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量2050g,1 2 3 M,电泳之后凝胶染色扫胶,转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同,转移膜的选择,最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素Nitrocellulose，NC膜和聚偏二氟乙烯Polyvinylidene Fluoride, PVDF膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交,湿转系统,注意事项 1.胶在负极，膜靠近正极 2.保证每层之间没有气泡 3.转膜过程产生大量热量，需冰浴,夹板 海绵 滤纸 凝胶 膜 滤纸 海绵,正极,负极,Hoefer 全能型转印系统,半干转印系统,Hoefer 半干转印系统,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程,转膜后检测,封闭,作用为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 封闭剂 5脱脂奶粉或BSA，或3明胶溶于TBST Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司,室温孵育1h或4过夜,注Tween-20的作用减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合,一抗、二抗孵育,1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。 3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。 5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 6.加入显色底物进行显色反应,不同标记的二抗及成像方法,125I标记的抗体 X-光片压片显色 荧光基团标记的抗体 凝胶成像仪,不同标记的二抗及成像方法,酶标抗体 如HRP（辣根过氧化物酶）、AP（碱性磷酸酶）等 成像方法加酶的底物产生显色反应或化学发光反应,显色反应TMB，CN，DAB等显色底物 优点方便、便宜，直接成像 缺点有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测,TMB，即3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，是辣根过氧化物酶的常用底物。 4CN中文名称为4-氯-1-萘酚,是过氧化物酶的发色底物,形成蓝紫色不溶性产物。二氨基联苯胺3，3-diaminobenzidine，DAB是过氧化物酶Peroxidase的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜 色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物,化学发光显色 标HRP二抗加ECL底物发光反应压片或CCD成像 优点灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、 特异性高、可重新剥离检测,辣根过氧化物酶horse radish peroxidase，简称HRP， Western-blot实验时，通常应用辣根过氧化物酶（HRP）标记的一抗或二抗，HRP可以 使发光底物Luminol产生化学发光，从而标记相应蛋白条带的位置和蛋白含量的多少。 ECL发光液含有化学发光底物和发光增强剂、稳定剂，产生信号迅速，信号持续时间长， 并且灵敏度高，能够检测到皮克（pg）级的蛋白,Western Blot结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer,Western blot protocol video,Southern blot , Northern blot和Western blot 比较,ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDS-PAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定,Southern blot,Northern blot,Western blot,原位杂交（ISH）是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交用放射性或非放射性如地高辛、生物素等标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补 的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可 通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析,6.1.3 原位杂交技术 in situ Hybridization，ISH,原理与特点,原理原位杂交以标记的外源基因为探针，在适宜的条件下，探针与固定在玻片上的细胞内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体，然后根据探针标记的性质进行检测，放射性同位素标记的探针用自显影检测。酶标记探针通过显色反应检测。 特点原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究，不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高。能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,地高辛标记,同位素标记,mRNA的互补链， 杂交信号集中于 纤维细胞中,负对照，mRNA的 同义链, 无杂交 信号,正对照，UBQ10杂交信号遍布于 整个胚珠,荧光原位杂交（FISH） 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的 位置,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交,芯片发展历史,Southern Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,6.4 生物芯片及数据分析,生物芯片（biochip）的概念 指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量,生物芯片技术及其应用,根据生物分子之间特异性相互作用的原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生的复性与特异性结合，设计一方为探针，并固定在微小的载体表面，通过分子之间的特性性反应，检测另外一方有无、多少或者结构改变等。 生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵microarray）。 未来最具发展潜力的技术,生物芯片的主要特点 常用的生物芯片的分类 基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室,高度并行性提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。 多样性可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。 微型化减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。 自动化降低成本，保证质量,生物芯片,亲和力 生物芯片,微阵列结构 生物芯片,DNA芯片,蛋白芯片,组织芯片,它们的应用原理都是基于生物分子之间的亲和作用力，如抗原和抗体的免疫结合，核酸分子的碱基配对作用等,它们处理或分离的对象包括实验初期的生物样品到实验结束时的反应产物,毛细管电泳芯片,PCR反应芯片,介电电泳分离芯片,生物芯片的分类,根据用途还可以把生物芯片分为两类信息生物芯片ination-biochip和功能生物芯片function-biochip,美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划，美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。 世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。 目前全世界有几百家基因芯片公司，有多种生物芯片问世，而且这些芯片的特点较以前密度更高，检测方法更精确，特异性更强的特点。而主要仍以少数几家公司为主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。 国内目前主要如清华大学、中科院生命科学院、上海复旦大学、北京军事医学科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司，而且可能还有一大批公司相继成立,一、基因芯片的诞生,基因芯片是信息时代的产物,横跨 生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术、光电技术、材料科学等现代高科技领域,什么是基因芯片,基因芯片gene chip，又称DNA微阵列microarray，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息,小鼠基因表达谱芯片MGEC,癌症相关基因表达谱芯片CRGEC,人类基因表达谱芯片HGEC,基因芯片的基本原理,任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列subsequence。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列,TTAGCTCATATG,这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列,原理 - 通过杂交检测信息,一组寡核苷酸探针,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,ATACGTTAGATC,TACGTTAG,由杂交位置确定的一组,核酸探针序列,GTTAGATC,杂交探针组,TATGCAATCTAG,重组的互补序列,靶序列,TACGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,基因芯片,荧光标记的样品,共聚焦显微镜,获取荧光图象,杂交结果分析,探 针 设 计,杂交,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,基因芯片的制备,基因芯片的制作方式,原位合成,直接点样,原位光蚀刻合成,原位喷印合成,分子印章法,针式点样,喷墨点样,光导原位合成法,样品的制备,样品的制备过程包括 核酸分子的纯化、扩增和标记,样本制备,制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。 用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达研究的样本是cDNA。 样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记,杂交与结果分析,一）杂交反应与传统的杂交方法类似 （二）杂交信号的检测最常用荧光法 （三）数据分析芯片杂交图谱的处理与存储由专 门设计的软件来完成,杂交与结果分析,是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步 样品在被测定前，首先要经过消化，使待测组织细胞中的DNA或RNA释放出来，在经过适当的扩增后，以荧光标记物标记放入基因芯片自动孵育装置（Fluidics Station）中，由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件，进行杂交，这一过程，仅需要数秒钟。杂交完成后，要对基因芯片进行“读片”，即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜，对基因芯片表面的每个位点进行检测。这种显微镜，将聚焦的平面设定为芯片的表面，因此可以检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记，而待测样品中未与芯片上探针结合的荧光标记物，则悬浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被检测,杂交与结果分析,样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素，但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多，因此，通过对信号强度的分析，就可以区分正确与错误的配对。 为了使结果的检验更加简便和快速Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站，对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析，仅需要数分钟的时间。这样在短短的几十分钟至数小时内，就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验,Laser 1,Laser 2,Detector 1,Detector 2,芯片的扫描,图像处理,Detector 1,Detector 2,False-color differential image,图 像 分 析,基因芯片的应用,基因芯片具有 巨大的应用前景 1. 基因功能分析研究 2. 检测与疾病相关的基因, 进而用于疾病诊断 3. 药物筛选, 4. 检测基因突变 5. 其他环境化学毒物的筛选 体质医学的研究,基因芯片应用 基因表达谱（gene expression pattern,Biological Sample,Functional Ination,红色 上调 黄色 不变 绿色 下调,基因功能分析研究,将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立,药物筛选,在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（high throughout screening），可使新药开发获得技术上的突破,Evanse and Relling Science , 286 5439 487, Oct 15,1999,6.1.4 基因定点突变技术,原理通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列， 用途 研究某个氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性以及结合配体能力的影响 改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点,方法,寡核苷酸介导的DNA突变含错配的寡核苷酸与目的序列退火；聚合酶延伸及连接酶连接；转化；分离 重叠延伸介导的定点突变诱变引物扩增出两种靶片断退火末端补平扩增 大引物诱变法正反（突变）向突变引物扩增产生大突变引物与野生型DNA和正向引物混合退火PCR,寡核苷酸介导的 DNA突变技 术,重叠延伸介导的定点诱变,大引物诱变法,1. 基本原理 经典遗传学Forward genetics是从一 个突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。 现代遗传学Reverse genetics，反向遗传学首先从基因序列出发，推测其表现 基因敲除gene knoc